Перепрограммирование Т-клеток

Ученые генетически перепрограммировали человеческие иммунные клетки, известные как Т-клетки, без использования вирусов для вставки ДНК.  С более быстрой, более дешевой, более точной техникой авторы заявляют, что это произошло «из-за гонки» к новой клеточной терапии.

Исследовательская группа создала основные руководства CRISPR, которые могли бы выражать зеленый флуоресцентный белок только в определенных сотовых местоположениях и структурах.

В достижении, которое имеет значительные последствия для исследований, медицины и промышленности, ученые генетически перепрограммировали человеческие иммунные клетки, известные как Т-клетки, без использования вирусов для вставки ДНК. Ученые заявили, что ожидают, что их техника – быстрый, универсальный и экономичный подход с использованием технологии редактирования генов CRISPR – будет широко использоваться в расширяющейся области клеточной терапии, ускоряя разработку новых и безопасных методов лечения рака, аутоиммунитета, и других заболеваний, в том числе редких наследственных расстройств.

Новый метод, описанный в выпуске Nature от 11 июля 2018 года, предлагает надежную молекулярную систему «вырезания и вставки» для перезаписи последовательностей генома в Т-клетках человека. Он опирается на электропорацию – процесс, в котором электрическое поле применяется к клеткам, чтобы их мембраны были временно более проницаемыми. После экспериментов с тысячами переменных в течение года исследователи UCSF обнаружили, что когда определенные количества Т-клеток, ДНК и «ножниц» CRISPR смешиваются вместе, а затем подвергаются воздействию соответствующего электрического поля, Т-клетки будут принимать в этих элементах и ​​интегрировать определенные генетические последовательности именно на месте запрограммированного CRISPR среза в геноме.

«Это быстрый и гибкий метод, который можно использовать для изменения, улучшения и перепрограммирования Т-клеток, чтобы мы могли дать им специфику, которую мы хотим уничтожить, распознать инфекции или убрать чрезмерный иммунный ответ, наблюдаемый при аутоиммунных заболеваниях», сказал Алекс Максон, доктор медицинских наук, доцент микробиологии и иммунологии, член UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center и старший автор нового исследования. «Теперь мы начинаем гонку на всех этих фронтах».

Но так же важно, как скорость и простота использования новой техники, сказал Марсон, также являющийся научным директором биомедицины в Инновационном институте геномики, заключается в том, что этот подход позволяет вставлять значительные участки ДНК в Т-клетки, которые могут наделять клетки мощными новыми свойствами. Члены лаборатории Марсона имели некоторый успех, используя электропорацию и CRISPR, чтобы вставлять фрагменты генетического материала в Т-клетки, но до сих пор многочисленные попытки многих ученых размещать длинные последовательности ДНК в Т-клетках приводили к смерти клеток, считалось, что большие последовательности ДНК чрезмерно токсичны для Т-клеток.

Чтобы продемонстрировать универсальность и силу нового метода, исследователи использовали его для восстановления генетической мутации, вызывающей болезни, в Т-клетках у детей с редкой генетической формой аутоиммунитета, а также создали настроенные Т-клетки для поиска и уничтожения клеток меланомы человека.

Вирусы вызывают инфекции путем инъекции собственного генетического материала через клеточные мембраны, и с 1970-х годов ученые использовали эту возможность, удаляя вирусы инфекционных признаков и используя полученные «вирусные векторы» для переноса ДНК в клетки для исследований, генной терапии и в широко распространенный недавний пример, для создания клеток CAR-T, используемых при иммунотерапии рака.

Т-клетки, сконструированные с вирусами, теперь одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для борьбы с некоторыми видами лейкемии и лимфомы. Но создание вирусных векторов – это кропотливый, дорогостоящий процесс, а нехватка векторов клинического класса привела к узкому месту производства как для генной терапии, так и для клеточных методов лечения. Даже в том случае, когда они доступны, вирусные векторы далеки от идеальных, поскольку они вносят гены случайно в клеточные геномы, что может повредить существующие здоровые гены или оставить вновь введенные гены неуправляемыми регулирующими механизмами, которые гарантируют нормальную работу клеток. Эти ограничения, которые потенциально могут привести к серьезным побочным эффектам, вызывают озабоченность как генной терапией, так и клеточной терапией, такой как иммунотерапия на основе CAR-T.

«Прошло тридцать лет работы в попытке получить новые гены внутри Т-клетки», – сказал первый автор Тео Рот, студент, преследующий докторскую степень и степень доктора философии в программе UCSF Medical Scientist Training, которая разработала и провела новое исследование в лаборатории Марсона. «Теперь больше не нужно иметь шесть или семь человек в лаборатории, работающей с вирусами, только для того, чтобы спроектировать Т-клетки, и если мы увидем сотни лабораторий, разрабатывающих эти ячейки, а не несколько, и работая со все большим количеством сложных ДНК-последовательностей, мы будем пытаться сделать так много возможностей, что это значительно ускорит развитие будущих поколений клеточной терапии».

Спустя почти год проб и ошибок Рот определил соотношения популяций Т-клеток, количества ДНК и количества CRISPR, которые в сочетании с электрическим полем, поставляемым с надлежащими параметрами, приведут к эффективному и точному редактированию Т-клеток геномов.

Чтобы подтвердить эти данные, Рот направил CRISPR на маркировку массива различных белков Т-клеток зеленым флуоресцентным белком (GFP), и результат был очень специфичным, с очень низким уровнем эффектов «вне цели»: каждая структура субклеточной структуры CROSPR была разработана для маркировки с помощью GFP, а другие нет, и светятся зеленым под микроскопом.

Затем, в дополнительных экспериментах, разработанных в качестве доказательства принципа терапевтического обещания новой техники, Рот, Марсон и его коллеги показали, как его потенциально можно использовать для систематизирования Т-клеток против аутоиммунного заболевания или рака.

В первом примере Рот и его коллеги использовали Т-клетки, предоставленные в лабораторию Марсона Йельской медицинской школой, Кеван Герольд, MD. Клетки пришли от трех братьев и сестер с редким, тяжелым аутоиммунным заболеванием, которое до сих пор было устойчивым к лечению. Геномное секвенирование показало, что Т-клетки у этих детей несут мутации в гене IL2RA. Этот ген содержит инструкции для рецептора клеточной поверхности, необходимые для развития регуляторных Т-клеток или Tregs, которые контролируют другие иммунные клетки и предотвращают аутоиммунитет.

С помощью невирусного метода CRISPR команда UCSF смогла быстро восстановить дефект IL2RA в детских Т-клетках и восстановить сотовые сигналы, которые были нарушены мутациями. В CAR-T терапии Т-клетки, которые были удалены из организма, разработаны для повышения их способности к борьбе с раковыми заболеваниями, а затем возвращаются в организм для лечения опухолей. Исследователи надеются, что подобный подход может быть эффективным для лечения аутоиммунных заболеваний, при которых Tregs нарушается, например, у трех детей с мутациями IL2RA.

Во втором наборе экспериментов, проведенных в сотрудничестве с Кристиной Пуиг-Саус, доктором философии и Антони Рибасом, MD, Институтом имплантации рака им. Паркера в Лос-Анджелесе, ученые полностью заменили рецепторы местных Т-клеток в популяции нормальных человеческих Т-клеток с новыми рецепторами, которые были специально спроектированы для поиска определенного подтипа клеток меланомы человека. Т-клеточные рецепторы – это датчики, которые клетки используют для обнаружения болезни или инфекции, а в лабораторных условиях сконструированные клетки эффективно размещаются в целевых клетках меланомы, игнорируя другие клетки, проявляя определенную специфичность, которая является основной целью прецизионной медицины рака.

Без использования вирусов исследователи смогли генерировать большое количество CRISPR-модифицированных клеток, перепрограммированных для отображения нового рецептора Т-клеток. При переносе на мышей, имплантированных опухолями меланомы человека, сконструированные человеческие Т-клетки попадали на участок опухоли и проявляли противораковую активность.

«Эта стратегия замены Т-клеточного рецептора может быть использована для любого рецептора Т-клеток», – сказал Марсон, также являющийся членом Института иммунотерапии рака им. Паркера в UCSF и Chan Zuckerberg Biohub Investigator. «С помощью этой новой техники мы можем вырезать и вставлять в указанное место, переписывая определенную страницу в последовательности геномов».

Рот сказал, что, поскольку новая техника позволяет создавать жизнеспособные пользовательские линии Т-клеток чуть более недели, она уже трансформировала исследовательскую среду в лаборатории Марсона. Идеи для экспериментов, которые ранее считались слишком сложными или дорогостоящими из-за препятствий, представленных вирусными векторами, теперь созрели для исследования. «Мы будем работать над «сумасшедшими» идеями, – сказал Рот, – потому что мы можем создавать шаблоны CRISPR очень быстро, и как только у нас будет шаблон, мы сможем получить его внутри Т-клетки и быстро вырастить».

Марсон приписывает успех нового метода «абсолютной стойкости» Рот перед лицом распространенных убеждений, что вирусные векторы необходимы и что только тонкие кусочки ДНК могут переноситься Т-клетками. «Тео был убежден, что если бы мы смогли найти правильные условия, мы могли бы преодолеть эти предполагаемые ограничения, и он приложил бы Геркулесовы усилия, чтобы проверить тысячи различных условий: отношение CRISPR к ДНК, различные способы культивирования клеток; различная электрическая энергия. Оптимизируя каждый из этих параметров и сочетая лучшие условия, он смог увидеть этот поразительный результат».

Калифорнийский университет Сан-Франциско